Uso de Pruebas Bioquímicas y Técnicas Rápidas para la ...

1 PROTOCOLOS DE PR CTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOG A EXPERIMENTAL FACULTAD DE QU MICA Departamento de Biolog a (1) Uso de Pruebas bioqu micas y T cnicas R pidas para la Caracterizaci n Fisiol gica de Bacterias (1 Sesi n) Objetivos Al finalizar este ejercicio el estudiante ser capaz de: Caracterizar mediante Pruebas bioqu micas o t cnicas r pidas una bacteria aislada Introducci n para que una c lula viva, crezca y se reproduzca, debe ser capaz de incorporar y transformar (mediante el metabolismo) los compuestos qu micos que necesita para obtener energ a (catabolismo), as como las mol culas que pasar n a formar parte de su material celular (anabolismo). Todas las reacciones qu micas que se llevan acabo son catalizadas por enzimas (catalizadores biol gicos de naturaleza proteica y actividad espec fica), las cuales se clasifican, de acuerdo al lugar del ambiente celular donde act an, en exoenzimas y endoenzimas.

2 Las Pruebas bioqu micas se emplean para identificar de forma clara y precisa, la presencia o ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas, o de una v a metab lica completa en uno o m s microorganismos. Una de las t cnicas r pidas m s usadas para la identificaci n de bacterias son las galer as API de bioMerieuxMR, las cuales permiten identificar levaduras, bacterias ent ricas, no ent ricas, especies de Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Campylobacter, y otras m s. En el laboratorio se emplean frecuentemente las galer as API 20E, que es un sistema estandarizado que permite la identificaci n de bacterias de la familia Enterobateriaceae y otros bacilos Gram negativos, no exigentes. Otro sistema que se emplea com nmente en la bacteriolog a es el sistema Vitek de bioMerieuxMR, el cual es un sistema automatizado en el cual se identifican a las bacterias mediante el empleo de una tarjeta adecuada al tipo de microorganismo, por ejemplo si es grampositiva, gramnegativa ent rica, etc.

3 Materiales Cultivos puros de las siguientes bacterias: Cepas problema (cultivos puros aislados) Material por equipo: Galerias API 20E (bioM rieuxMR) para la caracterizaci n fisiol gica r pida de enterobacterias. Tarjeta Vitek para la identificaci n de bacterias grampositivas. Placas de Petri con los siguientes medios de cultivo: 1 con Gelosa nutritiva 1 con Agar sangre 1 con Agar almid n 1 con Agar DNA 1 con Agar leche descremada Tubos de ensayo de 13x100 con los siguientes medios de cultivo: 2 con 5 a 7 mL de soluci n salina isot nica (SSI) est ril 2 con mL de Agar Citrato de Simmons inclinado 2 con 3 mL de Caldo nitrato con campana de Durham 2 con 3 mL de Caldo rojo de fenol m s sacarosa con campana de Durham 2 con 3 mL de Caldo rojo de fenol mas manitol con campana de Durham PROTOCOLOS DE PR CTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOG A EXPERIMENTAL FACULTAD DE QU MICA Departamento de Biolog a (2) 2 con 2 mL de caldo urea 4 con Rojo de Metilo / Voges Proskawer (RM/VP) 2 con mL de Agar Kligler inclinado 2 con mL de Gelatina nutritiva 2 con 2 mL del SIM 2 con mL de MIO y/o LIA 4 con 2 mL de Hugh & Leifson + glucosa Material que deben tener los alumnos.

4 Cepa problema (cultivo puro) con 24 horas de incubaci n previa Mecheros Asas Gradillas Piseta Pipetas de mL est riles Pipetas Pasteur est riles Material por grupo Matraces Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de aceite mineral est ril Incubadora a 37 C Equipo Vitek para la lectura de tarjetas. Densimat a) Siembra para caracterizaci n fisiol gica de bacterias. 1. Marcar las cajas por la parte inferior dividi ndolas en dos sectores. 2. Etiquetar las cajas y los tubos con SSI est ril y los medios de cultivo. 3. Con el cultivo de 24 horas de la bacteria problema, proceder a inocular un tubo con SSI est ril hasta obtener una Suspensi n de bacterias ligeramente turbia. 4. A partir de la Suspensi n anterior proceder a inocular los medios de cultivo en el orden que se indica a continuaci n: a) Por estr a recta el tubo que contiene citrato de Simmons. b) Mediante estr a recta uno de los sectores de cada una de las 5 placas de Petri.

5 C) Mediante asada los tubos que contienen caldo nitrato, Rojo de fenol+sacarosa, Rojo de fenol+manitol, caldo urea, y los dos con RM/VP. d) Por estr a recta y picadura el tubo que contiene Agar Kligler. e) Por picadura los tubos que contienen los medios de gelatina nutritiva, SIM, MIO y los dos con Hugh agregar a uno de estos ltimos aceite mineral est ril. 5. Incubar a la temperatura ptima de desarrollo determinada en la pr ctica anterior, y revisar a las 24 horas. Si hay desarrollo abundante guardar los medios de cultivo en refrigeraci n, y si el desarrollo es escaso incubar 24 horas m s. PROTOCOLOS DE PR CTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOG A EXPERIMENTAL FACULTAD DE QU MICA Departamento de Biolog a (3) Figura 8. Pruebas bioqu micas para la caracterizaci n fisiol gica de bacterias. b) Siembra de galer as API (20E) para caracterizaci n fisiol gica r pida de enterobacterias.

6 1. Etiquetar las galer as API en la leng eta lateral de la c mara de incubaci n. 2. Llenar con agua destilada, los alveolos del fondo de la c mara de incubaci n. 3. Colocar la galer a API dentro de la c mara de incubaci n. 4. A partir del tubo Suspensi n, proceder a inocular las galer as de izquierda a derecha. Introducir el in culo en los pozos de la galer a con ayuda de una pipeta Pasteur est ril ( para Estr a rectaAsadaPicadura y estr a rectaPicaduraCepa problema o de referenciaSuspensi n (SSI)Agregar aceite mineral est rilCitrato de SimmonsCaldo nitratosAgarKligerGelatina nutritivaSIMHugh& LeifsonMIO / LIARojo de fenol + sacarosaRojo de fenol + manitolCaldo UreaRojo de Metilo / VogesProskawerGelosa nutritivaAgaralmid nAgarleche descremadaAgarsangreAgarDNAPROTOCOLOS DE PR CTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOG A EXPERIMENTAL FACULTAD DE QU MICA Departamento de Biolog a (4) c pulapozoevitar la formaci n de burbujas en el fondo de los pozos, colocar la punta de la pipeta sobre la pared de la c pula, inclinando ligeramente la c mara de incubaci n hacia delante).

7 Tener cuidado de no mezclar el contenido de cada pozo una vez hidratado el medio de cultivo. 5. para las Pruebas CIT, VP y GEL, llenar el pozo y la c pula (ver Figura 9). para las otras Pruebas , llenar nicamente los pozos. para las Pruebas ADH, LDC, ODC, H2S y URE crear una atm sfera anaerobia llenando la c pula con aceite mineral est ril. 6. Inocular dos galer as por equipo, una con el tubo de la Suspensi n de la bacteria problema y la otra con la cepa de referencia. 7. Cerrar la c mara de incubaci n e incubar a la temperatura ptima de desarrollo determinada en la pr ctica anterior, durante 18 a 24 horas y realizar la lectura. Figura 9. Galerias API 20E (bioM rieuxMR) para la caracterizaci n fisiol gica r pida de enterobacterias c) Inoculaci n de tarjetas Vitek para caracterizaci n fisiol gica r pida de bacterias grampositivas. 1. Colocar 3 mL de soluci n salina y hacer una suspensi n de la bacteria grampositiva.

8 2. Ajustar la turbidez a de McFarland 3. Llenar los datos que se piden en el equipo y colocar la tarjeta en el carrusel de lectura 4. Pasar al siguiente equipo y confirmar los datos que pide. Iniciar el proceso 5. Esperar de 3 a 18 horas hasta que den los resultados de identificaci n. Precauciones generales Evitar tocar los medios de cultivo con la pipeta al ser inoculados. Respeta los tiempos de incubaci n para la prueba con galer as API. En caso de no haber crecimiento con ninguna prueba de la galer a, someter nuevamente a incubaci n. Disposici n de desechos 1. Esterilizar los tubos empleados para la preparaci n de la suspensi n bacteriana, desechar en tarja y posteriormente lavar con agua y jab n. PROTOCOLOS DE PR CTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOG A EXPERIMENTAL FACULTAD DE QU MICA Departamento de Biolog a (5) Uso de Pruebas bioqu (2 Sesi n) Lectura e interpretaci n de resultados.

9 Materiales Material por mesa: Hielo Frascos gotero con: Lugol HCl N Reactivo de TPD (preparar con alcohol isoam lico) Per xido de hidr geno al 3% Rojo de metilo Hidr xido de potasio al 40% -Naftol Soluci n A del reactivo de Griess Soluci n B del reactivo de Griess Zinc en polvo Reactivo de Erlich Material que deben tener los alumnos: Mecheros Gradillas Papel filtro (cuadros de 2x2cm) Portaobjetos Palillos de madera Metodolog a a) Caracterizaci n fisiol gica de bacterias. 1. Hem lisis. En las placas de agar sangre indique si la hem lisis fue parcial ( ) o total ( ). 2. Hidr lisis del almid n. En la placa de agar almid n agregue lugol alrededor de la estr a de desarrollo; la aparici n de color azul revela la presencia de almid n, en tanto que una coloraci n rojiza o parda indica la degradaci n del almid n y se considera la prueba positiva. 3. Hidr lisis de la case na.

10 En la placa de agar leche descremada observe si alrededor de las colonias hay un halo transparente. La desaparici n del color blanco de la leche indica que la prueba es positiva. 4. Licuefacci n de la gelatina. Colocar los tubos con gelatina nutritiva en hielo y observe si estos permanecen l quidos o se solidifican. El primer caso indica la hidr lisis de la gelatina y se considera la prueba positiva. 5. DNA-asa. En la placa de agar DNA adicione unas gotas de HCl ( N) alrededor de la estr a de desarrollo. Observe el contraste de color que se presenta alrededor del desarrollo con el resto de la placa. El ADN precipita con el HCl, por lo que la formaci n de un halo incoloro alrededor de las colonias indica que la prueba es positiva. 6. Oxidasa. Realice lo siguiente: a) Colocar un trozo de papel filtro en un portaobjetos. b) En condiciones as pticas, tomar con un palillo de madera una muestra del crecimiento obtenido en la placa de gelosa nutritiva y colocarla sobre el papel.