Cuantificación de bacterias cultivables mediante el método ...

1 ART CULO CORTO. Cuantificaci n de bacterias cultivables mediante el m todo de Goteo en Placa por sellado (o estampado) Masivo . Quantification of cultivable bacteria by the Massive Stamping Drop Plate method Andr s Corral-Lugo*, Yolanda Elizabeth Morales-Garc a*, Laura Abisa Pazos-Rojas*, Araceli Ram rez-Valverde**, Rebeca D bora Mart nez-Contreras*, Jes s Mu oz-Rojas*. Resumen Cuando se desea cuantificar el n mero de bacterias presentes en m ltiples muestras, los procedimientos de rutina suelen consumir mucho tiempo. En ese periodo las muestras podr an sufrir modificaciones en su poblaci n. En el presente trabajo se evalu una metodolog a alternativa para cuantificar bacterias cultivables de forma masiva, r pida y econ mica en la que se implica el sellado , estampado o impresi n de diluciones seriadas de muestras de diversa procedencia.

2 El tiempo requeri- do para preparar 22 muestras para su sellado en placa es de 15 minutos. El m todo se bas en realizar diluciones seriadas (base 10) de las muestras l quidas originales contenidas en una placa multipozos con la ayuda de una pipeta multicanal. Despu s, con un replicador se tom un volumen (aproximadamente 1,65 l) de muestra de cada pozo, que se inocul por sellado en un medio de crecimiento gelificado de inter s. Las placas se incubaron el tiempo necesario, se cont el n mero de colonias presentes en la diluci n contable y se calcul el n mero de Unidades Formadoras de Colonia por mililitro (UFC/. ml) para cada muestra. La metodolog a se denomin Goteo por sellado en Placa Masivo (GSPM) y ha sido aplicada para cuantificar exitosamente bacterias provenientes de diferentes muestras de laboratorio, por ejemplo, de cultivos l quidos, muestras cl nicas (como exudados y secreciones) y bacterias presentes en la riz sfera de plantas de ma z.

3 Sin embargo, la metodolog a GSPM podr a aplicarse para contabilizar masivamente a bacterias de cualquier otra procedencia. Palabras clave: UFC, goteo en placa, plaqueo, vaciado en placa, GSPM. Abstract In an attempt to quantify the number of bacteria present in a high number of samples, routine procedures are usually very time-consuming. During this period of time, bacterial population could be modified. In this work, an alternative for a mas- sive, quick and economic method was evaluated in order to count viable bacteria, consisting in the sealing or stamping of serial dilutions performed in samples from different origins. The time required to prepare 22 samples for plate stamping is only 15 minutes. The quantification was based in performing serial dilutions (10-fold) of the original liquid samples contai- ned in a multiwell plate using a multichannel micropipette.

4 Afterwards, using a replicator, the same volume of each sample (approximately 1,65 l) was recovered from each well, and then it was inoculated and sealed in a solid growth media of interest. Plates were incubated as needed, colonies were counted in the quantifiable dilution and Colony Forming Units per milliliter (CFU/ml) was calculated for each sample. We called this method Massive Stamping Drop Plate (MSDP) and it has been successfully applied to count bacteria from different lab samples, including liquid cultures, clinical samples (exudates * Laboratorio Ecolog a Molecular Microbiana, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiol gicas, Instituto de Ciencias, Benem rita Univer- sidad Aut noma de Puebla, M xico. ** Laboratorio cl nico del ISSSTEP, Av. San Baltazar Campeche, Puebla, M xico.)

5 Autor correspondencia: PhD. Jes s Mu oz-Rojas, Edificio 103 J, Ciudad Universitaria, San Manuel, M xico, C. P. 72570. Cuantificaci n Rev. Colomb. Biotecnol. de bacterias XIV No. 2 mediante Diciembreel2012. m todo 147-156 de Goteo en Placa por sellado (o estampado) Masivo 147. and secretions) and bacteria recovered from the rhizosphere of corn plants. However, MSDP could also be applied to mas- sively count bacteria from any other source. Key words: CFU, drop plate, plating, spread plate, MSDP. Recibido: febrero 17 de 2011 Aprobado: noviembre 29 de 2012. Introducci n ml de muestra de cada una de las diluciones seriadas La cuantificaci n de microorganismos es un elemento en las placas, donde se vac a posteriormente el medio cr tico en los estudios de ecolog a microbiana y mi- de cultivo a punto de gelificar (agar aproximadamente crobiolog a cl nica.

6 No solo es importante conocer a 45 C); sta se usa ampliamente para determinar el al responsable de un efecto ben fico o identificar al n mero de coliformes presentes en muestras de agua microorganismo potencial de causar alguna infecci n y alimentos, sin embargo el m todo podr a ocasionar severa, sino tambi n es importante saber el n mero de la muerte selectiva de algunas cepas sensibles a calor microorganismos implicados, para establecer si stos (Clarck, 1967), en este m todo se evita el plaqueo de ser n capaces de desarrollar una funci n ben fica o las diluciones pero el n mero de placas y medio de perjudicial. cultivo requerido es equivalente. Una de las t cnicas cuyo uso se ha intensificado para el recuento bacte- Distintas han sido las estrategias para contabilizar a los riano, es la t cnica de goteo en placa (Herigstad et microorganismos cultivables en muestras ambientales al.

7 , 2001; Hoben y Somasegaran, 1982), debido a que y de laboratorio; las cuales presentan ventajas y des- sta es f cil, r pida y econ mica. El goteo en placa ventajas. El conteo de bacterias podr a realizarse me- consiste en colocar gotas de 20 l de cada una de las diante el m todo del N mero M s Probable (NPM), diluciones seriadas, en placas de medio; despu s de ste es til para contabilizar bacterias que son dif ciles su crecimiento se cuenta el n mero de colonias pre- de aislar de una muestra, pero que pueden ser detec- sentes y se realizan los c lculos requeridos. La meto- tadas por la actividad de alguna caracter stica metab - dolog a de goteo en placa requiere de 1 a 2 pacas de lica. Por ejemplo el conteo de las especies bacterianas cultivo para monitorear todas las diluciones seriadas que son capaces de captar nitr geno atmosf rico, bajo de cada muestra, lo que facilita elevar el n mero de condiciones microaerof licas (Cavalcante y D berei- repeticiones experimentales y aumentar el tama o de ner, 1988) se ha realizado mediante el m todo NPM muestra para comparaciones estad sticas.

8 La eficien- usando medios semigelificados carentes de nitr geno; cia del m todo ha resultado muy similar a las t cnicas las tablas de Mac Grady son tiles en estos casos. de recuento por plaqueo (Hoben and Somesagar n, 1982). La metodolog a de recuento en placa por plaqueo es una metodolog a ampliamente utilizada (Hoben y So- Cuando se desea cuantificar el n mero de bacterias masegaran, 1982), que consiste en realizar diluciones presentes en m ltiples muestras, los procedimientos seriadas 1:10 y extender 100 l de cada diluci n en de rutina suelen consumir mucho tiempo. En ese pe- una placa; las placas se incuban hasta que las colonias riodo las muestras podr an sufrir modificaciones en su son apreciables para su recuento. Esta metodolog a poblaci n. Una metodolog a m s econ mica que el tiene la ventaja de tener un buen l mite de detecci n, recuento por goteo en placa y que puede manejar ma- sin embargo consume mucho tiempo durante los pla- yor cantidad de muestras es la metodolog a de goteo queos; en el caso de realizar el recuento de bacterias en placa 6X6 (Chen et al.)

9 , 2003). En este m todo se a partir de muestras cuya poblaci n se desconoce realizan diluciones seriadas (base 10) de las muestras se requiere realizar el extendido de 7 diluciones y la l quidas originales contenidas en una placa multipozos muestra original (para cada conteo) lo que significa con la ayuda de una pipeta multicanal, por lo que se consumir 8 placas de cultivo y alrededor de 25 minu- trabajan 6 muestras a la vez. Las diluciones realizadas tos para los plaqueos, sin tomar en consideraci n re- son dispensadas con la misma pipeta multicanal en peticiones. Para disminuir el tiempo de procesamiento una misma placa; raz n por la que se ha designado a de muestra, la metodolog a ha sufrido modificaciones esta metodolog a como cuantificaci n simult nea. La al paso del tiempo y en la actualidad se usan bolitas de nica desventaja es que hay que tener un buen mane- acr lico en lugar de un asa de vidrio para extender las jo de la pipeta multicanal a la hora de dispensar en el muestras.

10 Otra t cnica recuento de bacterias utilizada medio de cultivo pues de otra forma el goteo podr a es la de vaciado en placa, que consiste en colocar 1 mezclarse con diluciones vecinas. La dispensaci n de 148 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XIV No. 2 Diciembre 2012 147-156. cada una de las diluciones implica la toma de puntas Descripci n del m todo de cuantificaci n con la pipeta multicanal, la absorci n de muestra y su de bacterias GSPM. colocaci n en el medio de cultivo. mediante el m todo GSPM se cuantificaron bacterias En el presente trabajo se evalu la eficiencia de una me- presentes en diversos tipos de muestra en forma de todolog a alternativa para cuantificar bacterias cultivables suspensi n. Para ello, se colocaron 100 l de suspen- de forma masiva, r pida y econ mica en la que se im- si n bacteriana de cada una de las muestras explora- plica el sellado o estampado de diluciones seriadas de das en este trabajo, en la parte superior de una placa multipozos (fila A) (figura 1).