11. Separación de aminoácidos por cromatografía en capa ...

1 11. Separaci n de amino cidos por cromatograf a en capa fina y detecci n mediante reacci n con ninhidrina Jes s V. Jorr n Novo, M Nieves Abril D az, Jos A. B rcena Ruiz Departamento de Bioqu mica y Biolog a Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-C rdoba RESUMEN. La cromatograf a en capa fina es un caso de cromatograf a de reparto en la que los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes. Los elementos del sistema cromatogr fico son: soporte, fase estacionaria (disolvente A), y fase m vil o eluyente (disolvente B).

2 Es una t cnica simple en cuanto al equipamiento necesario (placa y tanque cromatogr fico) y de f cil desarrollo. El par metro experimental asociado a la t cnica es el Rf (coeficiente de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto entre la fase estacionaria y fase m vil, y que depende de su estructura qu mica y su hidrosolubilidad/liposolubilidad. A modo de ejemplo, y dentro de la presente pr ctica, se llevar a cabo la separaci n de una mezcla de amino cidos, que se revelar n e identificar n mediante la reacci n con la ninhidrina.

3 Palabras clave: an lisis cualitativo, biomol culas, coeficiente de reparto, reacciones coloreadas. Abreviaturas empleadas. CCF: cromatograf a en capa fina; TLC: thin layer chromatography. 1. INTRODUCCI N Y OBJETIVOS. Separaci n de mol culas por cromatograf a El estudio y caracterizaci n de las distintas biomol culas (az cares, l pidos, prote nas, cidos nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y purificaci n a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier material biol gico. Una de las t cnicas bioqu micas m s cl sicas y utilizadas para dicho fin es la cromatograf a.

4 La cromatograf a incluye una amplia gama de t cnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento f sico-qu mico en el que se basa la separaci n (cromatograf a de adsorci n, de reparto, de cambio i nico, de filtraci n molecular, hidrof bica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo (cromatograf a en papel, capa fina, en columna y de gases). Todas las t cnicas intentan explotar las diferencias f sicas, qu micas y biol gicas de las distintas biomol culas para llevar a cabo su separaci n y aislamiento.

5 Entre dichas propiedades podr amos citar: i) Diferencias en solubilidad en diferentes solventes, tanto org nicos como acuosos. ii) Diferencias en tama o y forma. iii) Diferencias en carga. iv) Diferencias en afinidad por otras biomol culas. Todas estas propiedades y, por tanto, la separaci n de diferentes compuestos est n influenciadas por las condiciones del medio de separaci n, pH, temperatura, fuerza i nica e hidrofobicidad. De forma general, en las t cnicas cromatogr ficas existe una distribuci n de las mol culas entre dos fases, la fase estacionaria o parte del sistema separador que permanece fija en el espacio, y la fase m vil que circula sobre la fase estacionaria en ntimo contacto con sta.

6 Cromatograf a de reparto En la presente pr ctica llevaremos a cabo una cromatograf a de reparto, en capa fina, para la separaci n de amino cidos. En la cromatograf a de reparto los componentes de una mezcla se separan en base a una distribuci n diferente entre la fase m vil y la fase estacionaria. El movimiento relativo de las mol culas a lo largo del sistema cromatogr fico es el resultado de un equilibrio entre las fuerzas de transmisi n o arrastre ejercido por la fase m vil en su desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas que tienden a frenar dicho desplazamiento.

7 Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en criterios de solubilidad) como de adsorci n. La teor a de la cromatograf a de reparto se basa en que, en general, si dos fases inmiscibles se encuentran en contacto una con otra y si una de las dos fases contiene un soluto, ste se distribuir entre ambas de acuerdo con sus solubilidades relativas. Dicho fen meno se denomina reparto y viene determinado por el coeficiente de reparto, que es la relaci n entre las concentraciones del soluto, en el equilibrio, en las dos fases.

8 En la cromatograf a de reparto tenemos un soporte inerte al que est unida la fase estacionaria l quida. La mezcla a separar junto con la fase m vil se hace avanzar a lo largo de la fase estacionaria por capilaridad. En dicho avance, la fase m vil arrastrar . consigo un porcentaje de mol culas de cada componente a separar de acuerdo con los respectivos coeficientes de reparto. La distancia recorrida por cada uno de los componentes de la muestra depender de la cantidad de solvente o eluyente que se haga pasar y de los coeficientes de reparto, de manera que si stos son diferentes aqu lla tambi n lo ser , siendo posible la separaci n si se utiliza el volumen de eluyente apropiado.

9 En su desplazamiento, las mol culas de soluto se distribuir n no puntualmente, sino formando un rea debido a que son parcialmente solubles en las dos fases y a otros fen menos tales como la difusi n. En la cromatograf a de reparto se suelen utilizar diversos materiales como soportes: almid n, celulosa, gel de s lice, xido de aluminio, etc. Aunque en 2. teor a se consideran inertes, pueden generar diferentes procesos de adsorci n, por lo que la separaci n ocurrir tambi n, en parte, debido a la interacci n entre las mol culas a separar con dicho soporte, la cual actuar a como fuerza de frenado.

10 La fase estacionaria se forma suspendiendo o embebiendo el soporte con el solvente adecuado; ste recubre las part culas del soporte y es retenido por adsorci n y/o capilaridad. El espacio entre las part culas del soporte ser . utilizado por la fase m vil para su desplazamiento. Debemos de tener en cuenta que como fase m vil se suelen utilizar solventes hidr fobos cuando haya que separar compuestos no polares y solventes acuosos cuando haya que separar sustancias polares. Por su parte, la fase estacionaria, que debe ser al menos parcialmente inmiscible con la m vil, suele ser por lo general hidrof lica, aunque tambi n pueden utilizarse compuestos hidr fobos.