Interpretación de las pruebas diagnósticas del virus SARS ...

1 Culo EspEcialActa Pediatr Mex. 2020;41(Supl 1) n de las pruebas diagn sticas del virus SARS-CoV-2 Interpretation of diagnostic tests for the SARS-Cov-2 virusIrma Virginia D az-Jim nezInfect loga pediatra, coordinadora del rea de Microbiolog a, Instituto Na-cional de Pediatr a, Ciudad de M xico. Recibido: 27 de mayo 2020 Aceptado: 15 de junio 2020 Correspondencia Irma Virginia D az-Jim art culo debe citarse comoD az-Jim nez IV. interpretaci n de las pruebas diagn sticas del virus SARS-CoV-2. Acta Pediatr M x 2020; 41 (Supl 1) identificarse un nuevo agente infeccioso viral, causante de neumon a grave, en Wuhan, como el virus SARS-CoV-2, la carrera contra el tiempo para obtener m todos de diagn stico r pidos y seguros se convirti en una prioridad. En la actualidad, para el diagn stico de la enfermedad de COVID-19, en la fase aguda, se cuenta con la t cnica de RT-PCR en la primera semana y, para conocer la formaci n de anticuerpos ante la infecci n posterior a la primera semana est la serolog a, con dos t cnicas: ELISA, recomendable para uso cl nico en los hospitales y, tentativamente, la inmunocroma-tograf a, porque a n faltan m s estudios para recomendar su CLAVE: SARS-Cov-2; neumon a; COVID-19; RT-PCR; anticuerpos; infecci n; ELISA; inmunocromatograf a new viral infectious agent causing severe pneumonia identified in Wuhan as the SARS-Cov-2, the race against time for fast and safe diagnostic methods became a priority.

2 Currently, for the diagnosis of Covid-19 disease in the acute phase, the RT-PCR technique in the first week and to know the formation of antibodies to infection after the first week, serology is available with two techniques. ELISA recommended for clinical use in hospitals and Immunochromatography, more studies are missing to recommend its : SARS-Cov-2; Pneumonia; COVID-19; RT-PCR; Antibodies; Infection; ELISA; ImmunochromatographyTodo inici en diciembre del 2019, al reportarse, en Wuhan, China, pacientes con neumon a de causa desconocida que desencaden un sin-n mero de estudios para la identificaci n del agente etiol gico, que es un nuevo beta corona- virus : SARS-CoV-2. Este virus es el causante de la enfermedad COVID-19 y el s ptimo coronavirus que infecta a los humanos. Desde su identificaci n se ha incrementado, exponencialmente, la cantidad de casos en todo el mundo. Es sorprendente la gran rapidez con la que se identific la causa, vali ndose de las diferentes t cnicas modernas para la secuenciaci n y obtenci n del ARN, que hizo posible, en alrededor de 1 mes, contar con el m todo diagn stico en la fase aguda, que es la PCR transcriptasa reversa (RT-PCR) para SARS-CoV-2.

3 En una l nea del tiempo puede observarse la secuencia de eventos en la que, desde que se reportan los casos de neumon a en Wuhan, pasaron solo 10 d as para tener la primera secuenciaci n del genoma del virus , lo que es Figura 1 S52 Acta Pedi trica de M xico2020 Suplemento 1;41 Infecci nen Wuhan,principios notifica presencia de neumon a de causa desconocida, diciembre 31 Confirmaci n nuevo Coronavirus por CDC China, enero n de 5 secuencias, enero aislamiento de SARS-Cov-2 fuera de China en Australia, enero 28. Obtenci n de las clonas en todo su largo del c DNA, febrero n del r SARS-CoV-2, febrero n de la pandemia por la OMS, marzo n de la primera secuenciaci n del genoma, enero de 14 del DNA Sint tico SARS-CoV-2, enero n de 12 de 14 DNA sint ticos de SARS-CoV-2, febrero n del RNA viral del SARS-CoV-2, febrero el nombre SARS-CoV-2, febrero ntesis de DNAR econstrucci n del SARS-CoV-2 Figura 1. Secuencia de la infecci n por az-Jim nez IV.

4 pruebas diagn sticas del virus SARS- CoV-2 Hasta el momento se dispone de dos tipos de t cnicas de laboratorio para el diagn stico de COVID-2019:1. Diagn stico agudo del virus SARS- CoV-2 en enfermedad aguda 3-7 d as: la prueba de referencia es la t cnica de reacci n en cadena de polimerasa transcriptasa reversa (RT-PCR), que es una prueba de biolog a molecular en la que se detecta y amplifica una o varias regiones espec ficas del Diagn stico de formaci n de anticuerpos contra el virus SARS-CoV-2 despu s de 7 d as: la prueba indicada es por medio de ELISA o inmunocromatograf a para la detecci n de anticuerpos IgM e IgG para el virus para detecci n del SARS-CoV-2 El SARS-CoV-2 es un virus de ARN monocate-nario de ~ 30 kb de tama o del genoma, que pertenece al g nero Coronavirus y a la familia Coronaviridae. La estructura del SARS-CoV-2 es similar a la del SARS-CoV con un tama o de viri n que var a de 70 a 90 nm. Las prote -nas virales de punta, membrana y envoltura del coronavirus est n incrustadas en la bicapa lip dica derivada de la membrana del hu sped que encapsula la nucleoc pside helicoidal que comprende ARN viral.

5 El genoma comprende 6-11 marcos de lectura abiertos (ORF) con 50 y 30 regiones flanqueadas no traducidas (UTR).1El m todo diagn stico de la infecci n, en su fase aguda, se basa en la detecci n del ARN viral de las muestras cl nicas de los pacientes infectados. Para ello se utiliza una t cnica de RT-PCR que detecta diferentes regiones gen micas constantes. Los protocolos autorizados por la OMS para la realizaci n de la RT-PCR para virus SARS-CoV-2 durante la pandemia son: CDC de China, Instituto Pasteur, Paris, Francia, CDC de Estados Unidos, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas de Jap n, Alemania Charite, Hong Kong HKU, Instituto Nacional de Salud de Tailandia y las regiones gen micas espec ficas que amplifican cada uno de estos protocolos. (Cuadro 1) En estas primeras t cnicas se lleva a cabo la extrac-ci n de cidos nucleicos en un equipo aparte y, posteriormente, se practica una PCR individual para cada uno de los primeros, esto implica un tiempo de procesamiento de 6 1.

6 Protocolos autorizados por la OMS y regiones gen n y protocolo aceptado por la OMSR egiones gen micas amplificadasCDC China, ChinaORF1ab y NInstituto Pasteur, Par s regiones en la regi n RdRpCDC Estados regiones del gene NInstituto Nacional de EnfermedadesInfecciosas, Jap nPancorona y m ltiples regiones. Prote na de puntaAlemania ChariteRdRp, E, NHKU, Hong Kong SAR Orf1b-nsp14, NInstituto Nacional de Salud de TailandiaNEn el trascurso de estos meses se han autorizado equipos comerciales que han acortado el tiempo de proceso de 6 a 3 horas, en los que es posible la extracci n, amplificaci n y lectura en un solo equi-po automatizado, con lo que disminuye el riesgo de contaminaci n del personal y de la este tipo de pruebas moleculares un punto cr tico es la toma de la muestra. Hasta hoy, las pruebas aceptadas por la OMS para RT-PCR S54 Acta Pedi trica de M xico2020 Suplemento 1;41para SARS-CoV- 2 son hisopados nasofar ngeos, far ngeos y, en pacientes intubados, aspirados ,3,4 Cuadro 2La toma de la muestra es un proceso cr tico para incrementar la sensibilidad de la prueba y disminuir el riesgo de contagio al tomador de la muestra.

7 Para esto deben cumplirse los est ndares de equipo de protecci n personal que constan de:5,6a) Cofia para cubrir la ) Lentes de protecci n ) Cubre bocas ) Bata quir rgica ) Doble guante ) Botas cumplirse los protocolos del CDC (Cen-ters for Disease Control and Prevention, USA) y el INDRE (Instituto Nacional de Diagn stico y Referencia Epidemiol gica) para el vestido y retiro del equipo de protecci n o y embalaje de muestras al laboratorio donde se procesar la muestraLas muestras de COVID-19 deben seguir el Reglamento Modelo de las Naciones Unidas y cualquier otro reglamento aplicable, de-pendiendo del modo de transporte utilizado. Puede encontrarse informaci n en la Gu a de la OMS para regulaciones para el transporte de sustancias infecciosas 2019-2020 (aplicable a partir del 1 de enero de 2019). Las muestras de pacientes de casos sospechosos o confir-mados deben transportarse como UN3373, Sustancia biol gica, Categor a B , cuando son para diagn stico.

8 Deber hacerse con triple embalaje: 1. Todas las muestras deber n estar conteni-das en un tubo con medio de transporte viral, perfectamente cerrado y etiquetado, que se manejar desde su toma hasta la recepci n en el laboratorio a temperatura entre 2 a 8 2. Tipos de muestras , material requerido y temperatura de transporte para la prueba de RT PCR SARS-Cov-2 Tipo de muestraMaterialTemperatura de transporteComentariosExudado far ngeo y nasofar ngeoMedio de transporte de dacr n o ray n con mango de pl stico (exudado far ngeo)Hisopos de dacr n o ray n con mango flexible (exudado nasofar ngeo )2-8 CEl exudado far ngeo y nasofar ngeo se deben colocar en el mismo tubo para incrementar la carga viralLavado bronquioalveolarContenedor est ril con medio de transporte viral2-8 CPuede haber diluci n del pat geno, pero a n as vale la pena tomarla. Se requie-ren como m nimo 2 mL (1 mL de lavado bronquioalveolar m s 1 mL de medio de transporte).Aspirado traqueal, aspirado nasofar ngeo o lavado nasalContenedor est ril con medio de transporte viral2-8 CSe requieren, como m nimo, 2 mL (1 mL de aspirado m s 1 mL de medio de transporte).

9 Biopsia de pulm nContenedor est ril con medio de transporte viral2-8 C2 cm3 de la parte visiblemente m s az-Jim nez IV. pruebas diagn sticas del virus SARS- CoV-22. Las muestras se colocar n en una gradilla dentro de una hielera r gida, que conten-dr refrigerantes para mantener la muestra entre 2 a 8 La hielera se colocar en otro contenedor para su transporte hasta el laboratorio donde se procesar .2,3En el trascurso de estos meses, diversas plata-formas moleculares han implementado nuevos equipos para identificaci n del SARS-CoV-2; por ejemplo: la plataforma Gene Xpert, con la prue-ba Xpert Xpress SARS-CoV-2 test de la compa a Cepheid, que amplifica los 2 genes: el gen de la prote na E y el gen de la prote na equipo Film Array Biofire ha agregado, a su panel de virus respiratorios, el SARS-CoV-2 ll con el nombre Panel Respiratorio Biofire que emite un reporte cualitativo en 45 minutos; detecta dos regiones gen micas del SARS-CoV-2: el gen de la prote na S y el gen de la prote na M.

10 Esta prueba permite, adem s de la identificaci n del virus SARS-CoV-2, la detecci n de 19 virus respirato-rios y la posibilidad de coinfecci n, que puede suceder en 17-20% de los casos. En la temporada invernal permitir diferenciar entre infecci n por Influenza A o B vs enfermedad pruebas est n autorizadas por la FDA (Fe-deral Drug Administration) y los equipos permiten automatizar completamente la extracci n, amplifi-caci n y lectura de la PCR. Son equipos peque os que permiten una implementaci n sencilla que deber n cumplir los est ndares de bioseguridad en el laboratorio de microbiolog a para el manejo de muestras con probable SARS-Cov-2, que son los mismos que la toma de la muestra. De las plataformas moleculares destaca un grupo de uso cercano al paciente (point of care) durante esta pandemia: la prueba para SARS-Cov-2 del equipo Abbot ID now permite el reporte en 5 mi-nutos. Fue aprobada por la FDA aunque el 14 de mayo tambi n public una alerta por el reporte de falsos negativos de la prueba .