Caryotype humain : Technique Indications

1 - Support de Cours (Version PDF) - Caryotype humain : Technique - IndicationsColl ge National des Enseignants et Praticiens de G n tique M dicale Dr C dric Le Caignec Service de g n tique m dicale, CHU Nantes, FranceDate de cr ation du document 2010-2011- Universit M dicale Virtuelle Francophone -- Support de Cours (Version PDF) - Table des mati resI Techniques conventionnelles du Caryotype Etape de culture des Obtenir des m taphases nombreuses et de bonne qualit .. Identifier les Les techniques classiques, utilis es en Les techniques sp Les techniques de haute r Description du Caryotype Le chromosome m La classification des Indications du Caryotype En p riode ant En p riode Patient pr sentant.

2 Couple pr sentant un trouble de la fertilit ou des avortements spontan s r p Devant un remaniement de structure familial Universit M dicale Virtuelle Francophone -- Support de Cours (Version PDF) - I TECHNIQUES CONVENTIONNELLES DU Caryotype CONSTITUTIONNELLe Caryotype est une Technique qui permet l tude des chromosomes d un individu. Cette Technique permet d'obtenir une image, en microscopie optique, des chromosomes d une cellule au cours de la m taphase ou de la prom taphase de la mitose.

3 En g n tique m dicale, le Caryotype contribue la mise en vidence de remaniements chromosomiques quilibr s ou d s quilibr s. La r solution d un Caryotype standard est celle d une bande chromosomique, soit environ 5 10 millions de paires de bases (m gabases). ETAPE DE CULTURE DES CELLULESTout pr l vement dont les cellules sont en division in vitro permet l tablissement d un Caryotype . Un pr l vement de sang veineux p riph rique recueilli st rilement sur tube h parinate de lithium est le plus souvent utilis pour r aliser un Caryotype constitutionnel en p riode postnatale.

4 Le sang total est incub 48 72 heures dans un milieu de culture contenant une lectine fort pouvoir mitog ne (phytoh magglutinine ou PHA) permettant une stimulation de la croissance des lymphocytes T. Les fibroblastes de la peau sont galement couramment utilis s en p riode postnatale mais demandent une culture cellulaire de une trois semaines. Le fragment tissulaire est recueilli dans un milieu de culture st rile additionn d'antibiotiques. En p riode ant natale, les amniocytes du liquide amniotique, les cellules trophoblastiques des villosit s choriales ou les lymphocytes du sang f tal sont utilis s.

5 Le temps de culture est variable selon le type de cellule analys . L tablissement d un Caryotype partir de liquide amniotique n cessite, en moyenne, un temps de culture de 6 10 jours. Le temps de culture peut tre plus long, parfois de plusieurs semaines, en raison de la faible quantit de cellules initiales en cas d amniocent se tr s pr coce ou en raison des nombreuses cellules en apoptose et des d bris cellulaires en cas d amniocent se OBTENIR DES M TAPHASES NOMBREUSES ET DE BONNE QUALIT Apr s la phase de multiplication des cellules, celles-ci sont bloqu es au stade de m taphase afin de pouvoir observer les chromosomes.

6 Pour se faire, on ajoute de la colchicine, produit d riv du colchique. Cette substance emp che la polym risation de la tubuline et donc la formation du fuseau mitotique. La mitose est bloqu e au stade de m taphase. On proc de ensuite au choc hypotonique. Cette tape, indispensable pour avoir un talement correct, entraine le gonflement des cellules par diff rence de pression osmotique. Les membranes cytoplasmique et nucl aire sont fragilis es. Les constituants cellulaires sont ensuite fix s gr ce un fixateur, par exemple un m lange acide ac tique m thanol.

7 Les - Universit M dicale Virtuelle Francophone -- Support de Cours (Version PDF) - cellules sont alors pr tes tre tal es. On laisse tomber quelques gouttes de cette pr paration sur une lame de verre. Le fait de faire tomber la suspension cellulaire fait clater les membranes fragilis es, lib rant ainsi les chromosomes qui restent toutefois group s. Les lames sont ensuite observ es en microscopie IDENTIFIER LES Les techniques classiques, utilis es en routineUne simple coloration au Giemsa permet de compter et de classer les chromosomes en fonction de leur taille et de leur indice centrom rique.

8 Les m thodes de marquage ou banding r v lent le long des chromosomes une alternance de bandes transversales, faiblement ou fortement color es, dont la disposition topographique est sp cifique de chaque paire chromosomique. Les bandes G (GTG) obtenues par d naturation enzymatique et les bandes R (RHG) par d naturation thermique ont chacune un contenu sp cifique en ADN. Ces deux marquages, en contretype, sont compl mentaires. Lorsque l on a une bande sombre avec l une des techniques, avec l autre on obtient une bande claire.

9 Le marquage r v le l'euchromatine c'est dire les r gions chromosomiques o l'ADN est pr f rentiellement transcrit et l h t rochromatine c'est dire les r gions chromosomiques o l'ADN est pr f rentiellement inactif. Un marquage en bandes G ou R permet de visualiser 300 600 bandes par lot haplo de de Les techniques sp cifiquesQuelques colorations sont sp cifiques de segments chromosomiques pr cis: les bandes C pour l'h t rochromatine constitutive (centrom res et constrictions secondaires), l'impr gnation argentique pour les organisateurs nucl olaires (r gions contenant les g nes des ARN ribosomiques ou NOR).

10 Les bandes Q (QFQ) par coloration la quinacrine et observation en fluorescence, sont superposables aux bandes G et colorent intens ment la partie distale, h t rochromatique, des bras longs de l'Y, certains centrom res et certains bras courts des Les techniques de haute r solutionL' tude des cellules en prom taphase (fin de prophase ou d but de m taphase) par synchronisation des cultures associ e l'incorporation d'analogues de bases (bromod soxyuridine ou BrdU) qui modifient les propri t s tinctoriales des bandes chromosomiques, permet d'am liorer la r solution du Caryotype et d'observer 600 800 bandes par lot haplo de de chromosomes.